Abstracto

Tuberculosis 2017: Caracterización de una probable lipasa GDSL, Rv1075c de Mycobacterium tuberculosis - Jashandeep Kaur, Universidad de Panjab

Jashandeep Kaur

La tuberculosis es provocada por Mycobacterium tuberculosis. Debido al aumento de diferentes organismos que bloquean los fármacos, se están realizando investigaciones para identificar nuevos objetivos farmacológicos. En la base de datos de TB, se han comentado algunas propiedades como especulativas y descripción de requisitos para asignar un trabajo. Se ha comentado Rv1075c sobre la lipasa GDSL. Las esterasas/lipasas GDSL tienen propiedades multiusos debido a la amplia especificidad del sustrato, por lo que algunas de ellas tienen actividad de tioesterasa, proteasa, arilesterasa y lisofosfolipasa. En este estudio, hemos clonado la propiedad Rv1075c en el vector pET28a, se comunicó en la cepa E. coli BL21 (DE3) pGro7 y la proteína se filtró mediante cromatografía Ni-NTA. Además, los fenómenos del sitio dinámico se crearon utilizando el procedimiento de mutagénesis coordinada por sitio. En vista de la descripción bioquímica, se encontró que fuerza el movimiento de la lipasa hacia la longitud de la cadena de carbono medio teniendo pNP-laurato como su sustrato ideal. Su temperatura y pH ideales fueron 37 °C y 9 °C, respectivamente; y estable hasta 60 °C y un rango de pH largo, pH5 a 11. Asimismo, se confirmó que pertenecía al subgrupo de hidrolasas SGNH de la clase de lipasas GDSL mediante el estudio de la actividad de los fenómenos del sitio dinámico. El movimiento del fenómeno del sitio dinámico se vio alterado en comparación con la proteína de tipo salvaje.

Las vías de digestión de lípidos de Mycobacterium tuberculosis favorecen el acceso a fuentes de carbono y energía durante la enfermedad. Se comentó que la proteína Rv1075c de M. tuberculosis era una proteína teórica racionalizada. Observamos que la agrupación de aminoácidos de Rv1075c confiere similitudes con otras lipasas/esterasas bacterianas y demostramos que tiene actividad esterasa, con tendencia a las grasas insaturadas de cadena corta, especialmente la derivación de ácido acético, con una actividad más elevada a 45 °C, pH 9. La mutagénesis sitio-directa reveló su conjunto de actividad de tres como Ser80, Asp244 e His247. Descubrimos además que rRv1075c hidrolizaba triacetina y tributirina, y se transportaba principalmente en la pared y capa celular. Su expresión se activó a pH 4,5, emulando el fagosoma ácido de los macrófagos. La transformación de Rv1075c provocó una disminución del crecimiento bacteriano en las células THP-1 y en los macrófagos determinados por células mononucleares de sangre periférica humana, y redujo la infección por M. tuberculosis en ratones. Nuestros datos sugieren que Rv1075c está involucrado en la digestión de ésteres y grasas insaturadas dentro de las células huésped.

LipN (Rv2970c) pertenece al grupo Lip de M. tuberculosis H37Rv y es homólogo de la lipasa sensible a hormonas humana. El catalizador mostró predilección por sustratos de cadena corta de carbono con una actividad óptima a 45 °C/pH 8,0 y una solidez entre pH 6,0 a 9,0. La actividad específica del compuesto fue 217 U/mg de proteína con pNP-butirato como sustrato. Hidrolizó la tributirina a di- y monobutirina. Se confirmó que los depósitos del sitio dinámico del catalizador eran Ser216, Asp316 e His346. La tetrahidrolipstatina, RHC-80267 y N-bromosuccinimida restringieron por completo la actividad de la proteína LipN. Curiosamente, Trp145, una acumulación de sitio no dinámico, mostró un papel útil para mantener la actividad del catalizador. La proteína se restringió en la parte citosólica de M. tuberculosis H37Rv. La proteína tenía la capacidad de incorporar éster de ácido butírico, metil butirato, en presencia de metanol. LipN tenía la capacidad de hidrolizar 4-hidroxifenilacetato a hidroquinona. La calidad no se comunicó en condiciones de cultivo in vitro, mientras que la expresión de la calidad de rv2970c se observó después de 6 h de infección de macrófagos por M. tuberculosis H37Ra. En condiciones de estrés in vitro individuales, la calidad se comunicó solo en condiciones de presión ácida. Estos hallazgos sugirieron que LipN es una carboxilesterasa inducible por ácido citosólico sin especificidad posicional para mostrar actividad con sustratos de cadena corta de carbono. Requiere Trp145, una estructura de sitio no dinámico, para su acción química. Este artículo está protegido por derechos de autor. Todos los derechos guardados. Este artículo está protegido por derechos de autor. Todos los derechos guardados.

Se ha comentado que Mycobacterium tuberculosis Rv3775 (LipE) es una posible lipasa. Sin embargo, su actividad lipasa nunca se ha descrito y su función exacta en la patogénesis de la tuberculosis (TB) no se ha estudiado por completo hasta la fecha. Sobreexpresamos y filtramos la proteína LipE recombinante (rLipE) y demostramos que LipE tiene una actividad lipasa/esterasa. rLipE tiende a sustratos de éster de cadena media, con una actividad máxima en hexanoato. Su actividad es más elevada a 40 °C y pH 9. Verificamos que rLipE hidroliza trioctanoato. Utilizando mutagénesis coordinada por sitio, confirmamos que el conjunto de actividades putativas esperadas de tres depósitos Ser97, Gly342 e His363 son fundamentales para la actividad lipasa de rLipE. La determinación de la calidad de lipE se llevó a cabo en condiciones específicas que imitan la actividad intracelular de M. tuberculosis. El cambio de calidad de lipE provocó una disminución fundamental del crecimiento bacteriano dentro de las células THP-1 y los macrófagos inducidos por células mononucleares de sangre periférica humana y una disminución de la enfermedad por M. tuberculosis en ratones (con una reducción de la carga bacteriana de aproximadamente 8 veces en los pulmones de los ratones). Nuestros datos sugieren que LipE funciona como una lipasa y es importante para el crecimiento intracelular de M. tuberculosis y la enfermedad in vivo.